Doctor en Medicina, PhD en Filosofía.

Nuestro laboratorio está interesado en los mecanismos por los cuales el espliceosoma se ensambla y funciona. Nos hemos centrado en las interacciones que ensamblan complejos de empalme alrededor de uno de los sustratos químicos, el sitio de ramificación del pre-ARNm, y en la dinámica estructural posterior en torno a este sitio. Estos estudios están proporcionando información sobre la "mecánica" de una gran máquina RNP, las funciones de las helicasas y las interacciones entre el ARN y las proteínas.

Antecedentes. La eliminación precisa de intrones es un paso esencial de la maduración de los pre-ARNm eucariotas y un punto de control para la regulación. La escisión de intrones se lleva a cabo mediante dos reacciones catalizadas por el espliceosoma, un complejo 50-60S compuesto por cinco ARNm pequeños y >100 proteínas. ¿Cómo funcionan juntas estas partes de la "máquina" del espliceosoma? ¿Cómo se modula el empalme?

¿Cómo se acopla el pre-ARNm a los snRNP?
Reordenamientos estructurales en el ensamblaje del pre-espliceosoma. Se requieren al menos ocho ATPasas/helicasas dependientes de ARN durante el ensamblaje y la función del pre-espliceosoma, aunque aún no se comprende cómo cada ATPasa/helicasa efectúa los reordenamientos y altera la interacción de los snRNP con el pre-ARNm. Estamos estudiando el primer paso dependiente de ATP en el ensamblaje del pre-espliceosoma y la ATPasa requerida, Prp5, como un evento de reordenamiento modelo. Descubrimos que Prp5 no solo hidroliza ATP para mediar la interacción del snRNP U2 con el sitio de ramificación del intrón, sino que también es un puente que proporciona interacción entre intrones entre los snRNP U1 y U2 durante la formación del pre-espliceosoma. Nos interesa saber qué mueve o posiciona exactamente Prp5 durante este proceso y estamos purificando complejos tanto antes como después de la hidrólisis de ATP por Prp5 para comparaciones bioquímicas y obtención de imágenes crio-EM.

¿Cómo se puede modular la actividad catalítica? 
Muchos sitios de empalme/ramificación (¡LA MAYORÍA en las células de mamíferos!) no son las secuencias óptimas. ¿Cómo se pueden utilizar para el empalme? Realizamos un análisis abierto en S. cerevisiae en busca de supresores de una mutación grave de intrones e identificamos varias proteínas espliceosómicas que mejoran considerablemente la capacidad del espliceosoma para utilizar sustratos que contienen mutaciones. Nuestro análisis de estos supresores y de otros identificados anteriormente condujo a un modelo nuevo y unificado por el cual actúan todos los supresores conocidos: la supresión de las mutaciones de sustrato resulta de la alteración del equilibrio entre las conformaciones del espliceosoma. Esto se asemeja a la codificación errónea del ARNt causada por el equilibrio alterado entre las conformaciones ribosomales abiertas/cerradas. Esta similitud mecanística sugiere que la alteración de los reordenamientos representa una forma evolutivamente conveniente de modular la selectividad del sustrato. Una modulación similar de la selectividad del sustrato puede explicar la capacidad de los espliceosomas de mamíferos para actuar sobre los sitios de empalme típicamente deficientes de los intrones empalmados alternativamente.

Sistemas ortogonales para la investigación en vivo de interacciones de centros catalíticos . Durante el empalme del pre-ARNm, el sitio de ramificación (BS) se empareja con una secuencia filogenéticamente invariante en el ARNm pequeño U2; esta interacción es esencial tanto para el ensamblaje del espliceosoma como para la catálisis de primer paso. La investigación detallada del comportamiento/dinámica del dúplex BS-U2 se ha visto limitada por la naturaleza altamente perjudicial de las mutaciones U2 que alteran el emparejamiento BS-U2. Por lo tanto, desarrollamos un sistema ortogonal en el que una segunda copia dedicada de U2 con una secuencia de unión a BS muy sustituida media el empalme de un gen reportero cognado. Este par ortogonal BS-U2 produce un segundo espliceosoma no esencial que permite la caracterización in vivo de la hélice BS-U2, el posicionamiento del nucleófilo de primer paso y su interacción con el núcleo del espliceosoma, con pocas restricciones. Estas propiedades nos permitieron demostrar que la estructura BS-U2 existe en el momento de la catálisis de primer paso.

Actualmente, se sabe poco sobre el núcleo catalítico del segundo paso. Estamos utilizando nuestros sistemas ortogonales para dilucidar el sitio de unión 3'SS dentro del núcleo del segundo paso. Estos experimentos demuestran que la estructura de ramificación formada en el primer paso se transloca en la secuencia de repetición de tripletes en U2 (GUAGUA) y el 3'SS luego se une en una geometría análoga a la del nucleófilo del primer paso. La introducción de conjuntos complementarios adicionales de mutaciones permitirá una mayor investigación mecanicista del núcleo del segundo paso.

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