PhD Gary J. Gerfen

El objetivo de nuestra investigación es determinar la función proteica mediante el estudio de las estructuras de estados intermedios generadas a lo largo de una vía de reacción determinada. Estos estados intermedios involucran formas transitorias de la proteína, el cofactor y el sustrato. En diversos sistemas enzimáticos, los intermediarios incluyen especies paramagnéticas en forma de metales y/o radicales orgánicos. Además, en sistemas que carecen de especies paramagnéticas endógenas, suele ser ventajoso introducir un radical estable "marcador de espín" que sirva como indicador de la estructura y la dinámica proteica. La espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (EPR) es idónea para la caracterización de todas estas clases de especies paramagnéticas. Por lo tanto, nuestras principales herramientas experimentales para la caracterización estructural incluyen técnicas avanzadas de EPR, como la modulación de la envolvente de eco de espín electrónico (ESEEM), la doble resonancia nuclear electrónica (ENDOR) y la espectroscopia de correlación hiperfina (HYSCORE). Las técnicas de doble resonancia electrónica pulsada (PELDOR) se utilizan para medir distancias entre marcas de espín introducidas mutagénicamente hasta 50 Å. Las simulaciones de la mecánica cuántica de espectros experimentales se desarrollan a partir de principios básicos para la determinación precisa de parámetros espectrales. En el caso de proteínas que no son susceptibles a técnicas de RMN o cristalográficas, se utilizan modelos de homología y cálculos de dinámica molecular para generar estructuras que puedan analizarse mediante técnicas de EPR. Se implementan instrumentación y técnicas espectroscópicas según las necesidades de los sistemas investigados. Un enfoque principal en este sentido es el desarrollo y la aplicación de la espectroscopía EPR/ENDOR pulsada y de onda continua de alta frecuencia. La HF-EPR/ENDOR extiende la espectroscopía EPR a campos magnéticos elevados y mejora las capacidades de la técnica para determinar la estructura molecular y electrónica.

Entre los ejemplos de proyectos que se encuentran actualmente en estudio se incluyen: la estructura de los sitios activos de las proteínas y los intermediarios del sustrato en la ribonucleósido trifosfato reductasa dependiente de coenzima B ₁₂ ; identidad y estructura de los radicales generados durante la catálisis por la prostaglandina H sintasa (COX o PGHS) y la citocromo c oxidasa; determinación de la estructura molecular de las kinesinas utilizando técnicas de marcaje de espín; HF-EPR/ENDOR de una variedad de especies radicales derivadas de proteínas y sustratos.

KI Sen, H. Wu, JM Backer y GJ Gerfen “La estructura de p85ni en la fosfoinosítido 3-quinasa de clase IA exhibe un desorden entre dominios” Biochemistry 49 2159-66 (2010).

MA Yu, T. Egawa, S.-R. Yeh, DL Rousseau y GJ Gerfen “Caracterización EPR de radicales aniónicos de ascorbilo y dióxido de azufre atrapados durante la reacción de la citocromo c oxidasa bovina con oxígeno molecular” J. Magn. Reson. 203 213-19 (2010).

MA Yu, T. Egawa, K. Shinzawa-Itoh, S. Yoshikawa, SR. Yeh, DL Rousseau y GJ Gerfen “Formación de radicales en la citocromo c oxidasa” Bioch. Biophys. Acta 1807 1295-304 (2011) PMID: 21718686.

J. Manzerova, V. Krymov y GJ Gerfen “Investigación de los intermediarios en la reacción de la ribonucleótido trifosfato reductasa de Lactobacillus leichmannii: una aplicación de la tecnología HF EPR-RFQ” J. Magn. Reson. 213 32-45 (2011).

M. Yu, T. Egawa, K. Shinzawa-Itoh, S. Yoshikawa, V. Guallar, S.-R. Yeh, DL Rousseau y GJ Gerfen “Dos radicales tirosilo estabilizan estados de oxidación altos en la citocromo c oxidasa para una conservación eficiente de la energía y la translocación de protones” J. Am. Chem. Soc. 134 4753-4761 (2012).

J. Sabat, T. Egawa, C. Lu, DJ Stehr, GJ Gerfen, DL Rousseau y S.-R. Yeh “Intermediarios catalíticos de la óxido nítrico sintasa inducible estabilizados por la mutación W188H”. J. Biol. Chem. 288 6095-6106 (2013).

NS Nemeria, A. Ambrus, H. Patel, G. Gerfen, V. Adam-Vizi, L. Tretter, J. Zhou, J. Wang y F. Jordan “El componente E1 del complejo 2-oxoglutarato deshidrogenasa humana forma un radical derivado de tiamina por oxidación aeróbica del intermedio enamina” J. Biol. Chem. 289 29859-29873 (2014).

CJ Roche., A. Talwar, AF Palmer, P. Cabrales, GJ Gerfen y JM Friedman “Evaluación de la capacidad de generar y preservar la bioactividad del óxido nítrico en eritrocruorina de lombriz de tierra altamente purificada: una hemoglobina polimérica gigante con posibles propiedades de sustituto de la sangre”. J. Biol. Chem. 290 99-117 (2015).

C. Chatterjee, MPMH Benoit, V. DePaoli, JD Diaz-Valencia, AB Asenjo, GJ Gerfen, DJ Sharp, H. Sosa "Modos de interacción distintos del dominio motor de la kinesina-13 en el microtúbulo" Biophys. J. 110 1593-1604 (2016).

NS Nemeria, GJ Gerfen, E. Guevara, PR Nareddy, M. Szostak, F. Jordan. "El complejo 2-oxoglutarato deshidrogenasa del ciclo de Krebs humano crea una fuente adicional de superóxido/peróxido de hidrógeno a partir del 2-oxoadipato como sustrato alternativo". Free Rad. Biol. Med. 108, 644-654 (2017).

AA DeColli, NS Nemeria, A. Majumdar, GJ Gerfen, F. Jordan, CL Freel Meyers "Descarboxilación oxidativa del piruvato por la 1-desoxi-D-xiulosa 5-fosfato sintasa, una enzima metabólica central en bacterias" J. Biol. Chem. 293 10857-10869 (2018).

NS Nemeria, GJ Gerfen, L. Yang y F. Jordan "Evidencia de una interacción funcional y regulatoria entre el complejo 2-oxoglutarato deshidrogenasa del ciclo del ácido tricarboxílico y la 2-oxoadipato deshidrogenasa en las vías de degradación de L-lisina, L-hidroxilisina y L-triptófano a partir de estudios in vitro" BBA - Bioenergetics 1859 932-939 (2018).