PhD Vladislav Verkhusha

La obtención de imágenes ópticas no invasivas, el seguimiento y la manipulación de los procesos metabólicos en mamíferos vivos es más factible dentro de la ventana de transparencia óptica del infrarrojo cercano (NIR) (650-900 nm), donde la absorbancia de la hemoglobina y la melanina disminuye significativamente y la absorbancia del agua sigue siendo baja. Las proteínas fluorescentes (FP) más desplazadas hacia el rojo de la familia similar a GFP tienen espectros de excitación y emisión fuera de la región NIR y sufren de bajo brillo y fotoestabilidad modesta. Los fotorreceptores fitocromos bacterianos naturales (BphP) utilizan un producto enzimático del hemo, la biliverdina de bajo peso molecular, como cromóforo.

Las BphP ofrecen muchas ventajas sobre otras proteínas naturales que contienen cromóforos. A diferencia de los cromóforos de los fitocromos no bacterianos, la biliverdina es omnipresente en los mamíferos. Esto hace que las aplicaciones de BphP en células, tejidos y mamíferos enteros de mamíferos sean tan fáciles como las de los FP similares a GFP convencionales, sin necesidad de suministrar cromóforo a través de una solución externa. Las BphP presentan una absorbancia y fluorescencia NIR, que están desplazadas hacia el rojo en relación con las de cualquier otro fitocromo, y se encuentran dentro de la ventana óptica NIR. Esto hace que las BphP sean espectralmente complementarias a otras sondas ópticas y herramientas optogenéticas existentes basadas en las familias de proteínas similares a GFP, flavoproteínas y rodopsinas. La arquitectura de dominios independientes y los cambios conformacionales pronunciados tras la fotoisomerización de la biliverdina hacen que las BphP sean plantillas atractivas para diseñar varias sondas codificadas genéticamente fotocontrolables.

En nuestro laboratorio, diseñamos nuevos FP, biosensores y herramientas optogenéticas basados en BphP. Estos incluyen FP NIR permanentemente fluorescentes y brillantes con resolución espectral, FP fotoactivables con luz NIR no fototóxica y FP reversiblemente fotoconmutables. También nos centramos en el diseño de reporteros NIR para interacciones proteicas y biosensores para iones y metabolitos intracelulares. Por último, diseñamos BphP para convertirlos en elementos optogenéticos que nos permiten regular de forma no invasiva los procesos intracelulares in vivo con luz NIR.

Aplicamos diversos enfoques de evolución dirigida de proteínas basados en el diseño racional basado en la estructura y la mutagénesis aleatoria de BphPs molde, citometría de flujo de alto rendimiento y espectroscopia de placas multipocillo. Estas técnicas convencionales permiten la detección de propiedades estándar de sondas codificadas genéticamente, como longitudes de onda de excitación y emisión, brillo, fotoestabilidad, estabilidad del pH y eficiencia de plegamiento. También desarrollamos nuevos enfoques de ingeniería de proteínas y de alto rendimiento para optimizar específicamente las construcciones basadas en BphP. Estos incluyen mediciones de tiempo de vida de fluorescencia resueltas en el tiempo, expresión en el espacio periplásmico bacteriano, detección de bibliotecas de mutantes en levaduras y en células de mamíferos utilizando vectores lanzadera e hipermutaciones somáticas inducibles.

Las sondas, biosensores y herramientas moleculares NIR resultantes se prueban en modelos de ratón y se aplican a varios estudios in vivo . Estas construcciones NIR extienden los métodos ópticos a la obtención de imágenes in vivo de tejidos profundos multicolores, el etiquetado de células y tejidos, la fotoactivación y el seguimiento, y la detección de actividades enzimáticas e interacciones proteicas en células, tejidos y mamíferos enteros. Las herramientas optogenéticas NIR diseñadas permiten manipular los procesos celulares con luz directamente a través de la piel de animales vivos.

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