Robert A. Coleman, Ph.D.

Imágenes de moléculas individuales de factores de transcripción implicados en el cáncer, la hematopoyesis y el envejecimiento

La tumorigénesis humana es un proceso complicado caracterizado por la pérdida de la capacidad de la célula para regular procesos celulares críticos, como la transcripción, el procesamiento y la traducción del ARN, lo que conduce a un crecimiento celular incontrolable. A medida que nuestra comprensión de la tumorigénesis se vuelve más sofisticada, se necesita un enfoque combinatorio para comprender mejor la acción dinámica coordinada de enzimas de múltiples subunidades muy grandes y complejos proteínicos que controlan estos procesos celulares clave. Los avances recientes en la obtención de imágenes de moléculas individuales brindan una ventana espaciotemporal sin precedentes para investigar las interacciones funcionales dinámicas entre estos ensamblajes de transcripción de múltiples subunidades grandes y heterogéneos y la cromatina en tiempo real. Además, la criomicroscopía electrónica de alta resolución y los ensayos de unión de todo el genoma nos permiten estudiar rápidamente las interacciones funcionales detalladas en sustratos fisiológicamente relevantes con cantidades limitadas de muestras. Armados con estos enfoques avanzados in vitro e in vivo, nuestro laboratorio busca obtener una comprensión mecanicista de cómo los complejos de transcripción regulan dinámicamente la expresión de las vías de supresión tumoral y cómo estos procesos se alteran en el cáncer.

En concreto, aplicamos estas herramientas para analizar de forma mecanicista cómo la proteína supresora de tumores p53 se comunica con múltiples conjuntos de transcripción, como los factores de remodelación de la cromatina (PBAF), los factores de reconocimiento del promotor central (TFIID) y la ARN polimerasa II, para sortear los efectos represores de la cromatina sobre la transcripción. También estamos aplicando estas mismas estrategias para estudiar cómo los mutantes oncogénicos de p53 y los complejos de remodelación de la cromatina funcionan de forma mecanicista para promover la formación de tumores. Nuestro objetivo a largo plazo es determinar el origen molecular del cáncer y otras enfermedades relacionadas con la disfunción hematopoyética, el desarrollo ocular y el envejecimiento utilizando nuestro enfoque multidisciplinario centrado en la obtención avanzada de imágenes de moléculas individuales, estudios de todo el genoma y biología estructural.

Desarrollo de sistemas de imágenes de moléculas individuales para estudiar cómo los factores de transcripción alteran la estructura de la cromatina y regulan la ráfaga transcripcional

Para entender cómo las proteínas interactúan con la cromatina a alta resolución temporal y espacial, nuestro grupo ha establecido numerosos sistemas in vitro e in vivo que utilizan colocalización de alta resolución, FRET de molécula única e imágenes dinámicas de células vivas. Sorprendentemente, nuestros estudios de imágenes de células vivas descubren que los factores de transcripción y los remodeladores de cromatina, incluidos p53, ARN polimerasa II y PBAF, entran y salen dinámicamente del genoma en centros espaciales de actividad en una escala de tiempo de segundos a minutos. La estructura de la cromatina de las secuencias diana subyacentes y las actividades enzimáticas asociadas con los factores de transcripción/remodeladores de cromatina dictan su ciclo dinámico y cinética de unión. Las mutaciones oncogénicas en los factores de transcripción también pueden afectar la cinética de unión de las proteínas asociadas que se están co-cargando en el genoma. Además, descubrimos que los perfiles de unión cinética de moléculas individuales de los factores de transcripción están asociados con diferentes estados celulares durante el desarrollo. Además, también estamos adaptando nuestros sistemas de imágenes para evaluar directamente la actividad enzimática de los remodeladores de cromatina y las enzimas que se translocan a lo largo del genoma.

En colaboración con el laboratorio de Rob Singer en Einstein, también hemos desarrollado un sistema de obtención de imágenes multicolor de moléculas individuales en células vivas para examinar cómo nuestros factores de transcripción regulan dinámicamente la explosión transcripcional de los genes supresores de tumores. Utilizando estos sistemas de obtención de imágenes, descubrimos que los patrones de unión de los factores de transcripción y la explosión transcripcional muestran efectos de memoria para ajustar la expresión de los genes. El trabajo futuro consistirá en desarrollar esta obtención de imágenes de alta resolución en ratones vivos y plataformas de detección de fármacos basadas en imágenes de células vivas que determinen rápidamente los efectos combinatorios de los inhibidores epigenéticos en diferentes tipos de células y células enfermas.

Dinámica de moléculas individuales y estudios estructurales de la transcripción mediada por TFIID

Como el TFIID es un actor central en la regulación de la iniciación de la transcripción por la ARN polimerasa II, queremos entender cuántos factores reguladores diferentes acceden a este factor clave de reconocimiento del promotor central durante la formación del complejo de preiniciación de la transcripción (PIC). Con este fin, nuestros estudios de moléculas individuales in vitro revelaron que p53 carga dinámicamente el TFIID en los promotores nativos. Curiosamente, una vez unido al ADN, el TFIID indujo la disociación del p53 del complejo para permitir que moléculas adicionales de p53 escoltaran a factores de transcripción generales, como la ARN polimerasa II, hasta el andamiaje del promotor unido al TFIID. Los estudios futuros utilizarán la colocalización de moléculas individuales y la FRET para comprender mejor el papel de la cromatina en la regulación de la formación del PIC mediada por p53.

Mi grupo también ha colaborado con el laboratorio del Dr. Wei-Li Liu en Einstein para establecer un sistema para “construir” conjuntos mediados por p53 y TFIID involucrados en la formación de PIC tanto para estudios estructurales de moléculas individuales como crio-EM. Utilizando este sistema, determinamos la estructura crio-EM 3D de un complejo ternario p53/TFIID/TFIIA unido a dos ADN promotores nativos diferentes regulados por p53. El análisis crio-EM 3D indicó que p53 induce una arquitectura global común de TFIID unido a estos promotores nativos. También hemos determinado la estructura crio-EM 3D de p53 unido a la ARN polimerasa II. En esta estructura, p53 ocupa una posición en la ARN polimerasa que normalmente está unida por factores de elongación. Los ensayos bioquímicos in vitro revelaron que p53 estimula la elongación de la transcripción de la ARN polimerasa II, lo que sugiere un mecanismo estructural común asociado con la regulación de la elongación. Nuestros sistemas recientemente establecidos han allanado el camino hacia la construcción de grandes conjuntos multiméricos con el objetivo final de examinar estructuralmente cómo estos complejos se acoplan a los nucleosomas que rodean al promotor central.

1.     Kenworthy CA, Haque N, Liou SH, Chandris P, Wong V, Dziuba P, Lavis LD, Liu WL, Singer RH y Coleman RA . Los bromodominios regulan la orientación dinámica del complejo de remodelación de cromatina PBAF a los centros de cromatina. Biophys J. 30 de marzo de 2022;S0006-3495(22)00237-5. doi: 10.1016/j.bpj.2022.03.027. PMID: 35364106.

2.     Senecal A, *Singer RH y * Coleman RA. La cinética de las ráfagas transcripcionales está vinculada a la memoria transcripcional a corto plazo. *autores correspondientes. bioRxiv . 2 de noviembre de 2021. doi: https://doi.org/10.1101/2021.10.31.466715 .

3.     Desai RV, Chen X, Martin B, Chaturvedi S, Hwang DW, Li W, Yu C, Ding S, Thomson M, Singer RH, Coleman RA, Hansen M y Weinberger LS. Descubrimiento de un mecanismo celular que regula el ruido transcripcional. Science. 22 de julio de 2021:eabc6505. doi: 10.1126/science.abc6506. En línea antes de su publicación. PMID: 34301855.

4.     Liou SH, Singh SK, Singer RH, *Coleman RA y *Liu WL. Estructura del ensamblaje p53/ARN polimerasa II. Commun Biol. 25 de marzo de 2021;4(1):397. doi: 10.1038/s42003-021-01934-4.PMID: 33767390 *autores correspondientes.

5.     Drosopoulos W, Vierra DA, Kenworthy CA, * Coleman RA y * Schildkraut CL. Ensamblaje y desensamblaje dinámico de la ADN polimerasa δ humana en el genoma in vivo . Cell Rep. 4 de febrero de 2020;30(5):1329-1341.e5. doi: 10.1016/j.celrep.2019.12.101. Pubmed PMID: 32023453*autores correspondientes

6.     Carvajal LA, Ben Neriah D, Senecal A, Benard L, Thiruthuvanathan V, Yatsenko T, Narayanagari SR, Wheat JC, Todorova TI, Mitchell K, Kenworthy C, Guerlavais V, Annis DA, Bartholdy B, Will B, Anampa JD, Mantzaris Yo, Aivado M, Cantante RH, Coleman RA, Verma A, y Steidl U. Inhibición dual de MDMX y MDM2 como estrategia terapéutica en leucemia. Science Translational Medicine 11 de abril de 2018 Vol. 10, número 436, eaao3003. DOI: 10.1126/scitranslmed.aao3003. PMID de Pubmed: 29643228.

7. *Coleman RA, Zhen Q, Singh SK, Peng CS, Cianfrocco M, Zhang Z, Song L, Piasecka A, Aldeborgh H, Basishvili G, Rice W y *Liu WL. p53 dirige dinámicamente el ensamblaje de TFIID en el ADN objetivo. Mol Cell Biol., 15 de junio de 2017;37(13). pii:e00085-17. Doi: 10.1128/MCB.00085-17. PubMed PMID: 28416636. *Autores correspondientes

8. Singh SK, Qiao Z, Song L, Jani V, Rice W, Eng E, Coleman RA y Liu WL. Visualización estructural del ensamblaje p53/ARN polimerasa II. Genes Dev. 15 de noviembre de 2016;30(22) 2527-2537. PubMed PMID: 27920087 .